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山東博韋爾生物科技有限公司

Shandong Bowell Biotechnology Co., Ltd.

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關(guān)于色譜柱相關(guān)的問(wèn)題

色譜柱可分為填充柱和開(kāi)管柱兩大類(lèi)。

多為金屬或玻璃制作。有直管形、盤(pán)管形、U形管等形狀。液相色譜通常均采用填充柱。色譜柱的分離效果取決于所選擇的固定相,以及色譜柱的制備和操作條件。

1、網(wǎng)上對(duì)柱子是否可以反沖一直有爭(zhēng)論,那什么樣的柱子可以反沖,什么不可以。反沖后是正者用,還是反著用。具體到各型號(hào)柱子不僅是ODS柱,其他如正向柱、氨基柱、離子交換柱等最好都有解釋。

答:一般的正相反相柱應(yīng)該都能反沖,只有兩端篩板孔徑不對(duì)稱(chēng)的柱子不能反沖,不過(guò)目前這樣的柱子已經(jīng)比較少見(jiàn)了。反沖是為了把柱頭的污染物沖洗掉,反沖后還是正著用比較好,以免柱子的兩頭都被污染。我們一直提倡的是:正向使用,反向沖洗。

2、我在做方法開(kāi)發(fā)的時(shí)候,用乙腈和水作為流動(dòng)相,在調(diào)整梯度的時(shí)候發(fā)現(xiàn),剛開(kāi)始用60%乙腈, RT為2.5分鐘,調(diào)到40%乙腈,RT沒(méi)有變化,30%也沒(méi)有變化,一直調(diào)到20%的時(shí)候,RT突然變到了約13分鐘,請(qǐng)問(wèn)這是什么原因?我用的是離子交柱。

答:離子交換柱的保留時(shí)間主要由洗脫液的離子強(qiáng)度和pH決定,你現(xiàn)在講的比較簡(jiǎn)單,需要把你的方法說(shuō)的詳細(xì)一點(diǎn)才能做具體的分析。譬如分析物是什么情況,其含有極性電離基團(tuán)和非極性基團(tuán)是什么性質(zhì)?離子交換柱是聚合物基質(zhì)還是硅膠基質(zhì)?水相是什么緩沖鹽?

3、對(duì)于一根常用的c18柱,拿到一根新柱的時(shí)候應(yīng)該怎樣進(jìn)行活化及維護(hù)?為什么要這樣做?

答:新柱活化,實(shí)際上是一個(gè)平衡的過(guò)程,除了用流動(dòng)相平衡外,有時(shí)候還必須用所測(cè)樣品對(duì)新柱進(jìn)行平衡,特別是測(cè)定分子量比較高的多肽,尤其重要。因?yàn)榉肿恿扛叩奈镔|(zhì)分子,擴(kuò)散速度慢,平衡所需時(shí)間也相應(yīng)較長(zhǎng)。具體平衡方式也很簡(jiǎn)單,多進(jìn)幾次樣品,直到峰面積和保留時(shí)間穩(wěn)定,再進(jìn)行正式進(jìn)樣測(cè)定。

如果要加快平衡時(shí)間,把前面用來(lái)平衡的進(jìn)樣樣品濃度加大,或者不等洗脫完成,連續(xù)進(jìn)樣多針。用待測(cè)物對(duì)新柱平衡,目的是將硅膠基質(zhì)填料表面具有非特異性吸附的位點(diǎn)的吸附能力飽和掉。

4、測(cè)定多肽,一般采用什么柱子?流動(dòng)相是乙腈和水,還有微量的TFA。特別是像類(lèi)似三肽的短肽,應(yīng)該怎么選擇柱子?

答:分子量不高的多肽一般選用常規(guī)C18柱就能測(cè)定,也有用離子交換柱、水性C18柱和Hilic親水作用柱的。

5、氨基柱在進(jìn)酸性樣品時(shí),很傷柱子,如使用一段時(shí)間后,柱效降低,峰形改變,如何恢復(fù)?

答:氨基柱測(cè)酸性樣品,應(yīng)該是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能會(huì)使略帶負(fù)電荷的氨基官能團(tuán)質(zhì)子化,導(dǎo)致使用一段時(shí)間后對(duì)于某些類(lèi)的分析物保留性質(zhì)有所改變或表現(xiàn)在柱效下降。建議:用5-10倍的柱體積的含0.5-1.0%NH3的乙腈-水(50:50)溶液沖洗該柱(沖洗后當(dāng)然要再用不含堿的流動(dòng)相洗去多余氨),之后再進(jìn)行分析這類(lèi)酸性分析物時(shí)建議在流動(dòng)相中略微添加少許氨如0.1%。

6、色譜柱的技術(shù)都有哪些?比如封尾等,這些技術(shù)在應(yīng)用時(shí)都體現(xiàn)在哪里?

答:色譜柱技術(shù)包括填料技術(shù)和裝柱技術(shù),填料技術(shù)自不待言,填料的好壞對(duì)色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響。裝柱技術(shù)也沒(méi)有想象中的這么簡(jiǎn)單,不同固定相、不同粒徑、不同柱管內(nèi)徑和長(zhǎng)度,裝柱工藝都有所不同,要裝出緊密、穩(wěn)定、均一的柱床,更多是一門(mén)藝術(shù),需要經(jīng)驗(yàn)積累。

國(guó)內(nèi)和國(guó)外想比,我認(rèn)為色譜柱的差距在于:國(guó)內(nèi)公司以前都不會(huì)自己開(kāi)發(fā)填料,一般買(mǎi)國(guó)外現(xiàn)成填料裝柱,買(mǎi)到的填料質(zhì)量控制權(quán)不在自己手里。另外因?yàn)檠b柱歷史短,經(jīng)驗(yàn)積累少,裝柱工藝也沒(méi)有完全達(dá)到國(guó)外水平。另外,對(duì)色譜柱性能很關(guān)鍵的基礎(chǔ)材料-----裸硅膠,國(guó)產(chǎn)的還不過(guò)關(guān),在純度、粒徑和孔徑的均一性方面和國(guó)外產(chǎn)品相比,差距很大。

7、色譜柱技術(shù)的差距在哪里?

答:色譜柱技術(shù)包括填料技術(shù)和裝柱技術(shù),填料技術(shù)自不待言,填料的好壞對(duì)色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響。裝柱技術(shù)也沒(méi)有想象中的這么簡(jiǎn)單,不同固定相、不同粒徑、不同柱管內(nèi)徑和長(zhǎng)度,裝柱工藝都有所不同,要裝出緊密、穩(wěn)定、均一的柱床,更多是一門(mén)藝術(shù),需要經(jīng)驗(yàn)積累。

國(guó)內(nèi)和國(guó)外想比,我認(rèn)為色譜柱的差距在于:國(guó)內(nèi)公司以前都不會(huì)自己開(kāi)發(fā)填料,一般買(mǎi)國(guó)外現(xiàn)成填料裝柱,買(mǎi)到的填料質(zhì)量控制權(quán)不在自己手里。另外因?yàn)檠b柱歷史短,經(jīng)驗(yàn)積累少,裝柱工藝也沒(méi)有完全達(dá)到國(guó)外水平。另外,對(duì)色譜柱性能很關(guān)鍵的基礎(chǔ)材料-----裸硅膠,國(guó)產(chǎn)的還不過(guò)關(guān),在純度、粒徑和孔徑的均一性方面和國(guó)外產(chǎn)品相比,差距很大。

8、柱子在什么情況下可以清洗一下篩板呢?原來(lái)也討論過(guò)這個(gè)問(wèn)題,我也拆下來(lái)清洗過(guò),但我看到柱前段的污染更甚,于是就用刀片刮了刮,然后把清洗好的篩板安裝上去。問(wèn)題解決了,但使用壽命會(huì)不會(huì)減少呢?

答:柱頭污染了,就取出污染的,再裝一些填料。因?yàn)榧尤肽愎瘟诵┨盍,那么微觀(guān)的塔板數(shù)就少了。假入你刮得不多,僅表面,可能就是一些臟物,所以,問(wèn)題解決。但是今后還會(huì)有同樣問(wèn)題,再掛,那么不小心刮,影響柱效。建議還是裝一個(gè)預(yù)柱。

9、如果柱子取下來(lái)放置一段時(shí)間,需要做什么保護(hù)嗎?

答:對(duì)一般的反相柱,也就是洗干凈后放到純甲醇(乙腈)或者是80%左右的甲醇(乙腈)水中,然后用堵頭塞緊柱兩頭,以免保存溶劑揮發(fā),應(yīng)該不需要做特殊的保護(hù)。


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